7.3.2. Определение активности каталазы в мозге

 

Принцип метода. Смотри методику определения активности каталазы в крови.

Отбор проб и их хранение. Крыс забивают декапитацией. Вскрывают череп, быстро извлекают головной мозг и переносят в ледяной раствор 0,9 %-ного хлорида натрия. Через 1–2 мин мозг обсушивают фильтровальной бумагой, очищают от сосудистой оболочки и на холоде отделяют кору больших полушарий головного мозга. Из коры больших полушарий в стеклянном гомогенизаторе готовят 10 %-ный (1 г мозга + 9 мл среды) гомогенат на 0,9 %-ном растворе хлорида натрия. Полученный гомогенат центрифугируют при 3000 об./мин (850 g) в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают и заново центрифугируют при 14000 об./мин в течение 20 мин. Супернатант сливают в охлажденные пробирки и используют в качестве источника фермента.

Оборудование. Низкоскоростная центрифуга с охлаждением, центрифуга на 20 000 об./мин с охлаждением, стеклянный гомогенизатор с тефлоновым пестиком, термостат, колориметр.

Реактивы и их приготовление.

1. 0,9 %-ный раствор хлорида натрия.

2. 4 %-ный водный раствор молибдата аммония.

3. 0,02 %-ный раствор перекиси водорода.

4. Реактивы для определения белка по методу Лоури.

Ход определения. Инкубационная среда для определения активности фермента включает 0,1 мл исследуемого материала и 2 мл 0,02 %-ной перекиси водорода.

В пробирки разливают по 2 мл перекиси водорода, предварительно прогревают их до 25 °С. Затем в каждую пробирку вносят по 0,1 мл супернатанта. В контрольную пробирку вместо ферментативного препарата вносят 0,1 мл бидистиллированной воды. Пробы инкубируют в течение 10 мин при 25 °С. По истечении времени реакцию останавливают добавлением 1 мл 4 %-ного раствора молибдата аммония. Оптическую плотность проб измеряют при длине волны 410 нм в кювете с длиной оптического пути 5 мм против воды.

Об активности каталазы судят по степени уменьшения оптической плотности в опытных пробах (Ео), по сравнению с контрольной (Ек): DЕ = Ек – Ео.

Активность фермента (мкмоль Н2О2/мг белка/мин) рассчитывают по формуле

,

где К – коэффициент пересчета единиц оптической плотности в мг перекиси водорода, рассчитывают по калибровочному графику; М – молекулярная масса перекиси водорода; t – время реакции, мин; С – содержание белка в пробе, мг.