7.3. Определение активности каталазы

 

7.3.1. Определение активности каталазы в крови

 

Принцип метода. Об активности фермента судят по скорости убыли перекиси водорода в среде инкубации. Концентрацию перекиси водорода определяют по реакции с молибдатом аммония, который дает стойкий окрашенный комплекс.

Оборудование. Центрифуга с охлаждением, магнитная мешалка, термостат.

Реактивы и их приготовление. Все реактивы готовят на бидистиллированной воде.

1. 0,9 %-ный раствор хлорида натрия.

2. 4 %-ный раствор молибдата аммония (х. ч.). В воде в мерной колбе на 100 мл при нагревании растворяют 4 г молибдата аммония. При комнатной температуре раствор устойчив в течение нескольких недель.

3. 0,1 н. раствор перманганата калия. Готовится из фиксанала.

4. 10 %-ный раствор серной кислоты. 5,99 мл 91,6 %-ной кислоты (плотность 1,822 г/мл) разбавляют до 100 мл водой.

5. Реактивы для определения гемоглобина аммиачным методом.

6. 0,034 %-ный раствор перекиси водорода. Готовят из пергидроля. По мере хранения концентрация пергидроля снижается. Точную концентрацию перекиси водорода определяют титрованием перманганатом калия.

Порядок титрования. Зная приблизительно концентрацию пергидроля (25–30 %), готовят 1 %-ный раствор перекиси водорода. Для чего 1 мл исходной перекиси водорода доводят водой до 25 мл. Берут 1 мл разбавленной (1 %) перекиси водорода, добавляют 9 мл воды и 5 мл 10 %-ной серной кислоты. Титруют 0,1 н. раствором перманганата калия до слабо розового окрашивания.

Примерный пересчет. Допустим, на титрование ушло 5,8 мл перманганата калия. Вычисляют, сколько г-экв перманганата калия содержалось в 5,8 мл и участвовало в реакции:

1 000 мл – 0,1 г-экв

5,8 мл – х г-экв

х = 0,00058.

При титровании 1 г-экв вещества взаимодействует с 1 г-экв другого вещества. Значит, в реакции участвовало также 0,00058 г-экв перекиси водорода. Эквивалентная масса Н2О2 равна 17,01 г. Следовательно, анализируемый раствор содержит: 0,00058·17,01 = 0,00987 г Н2О2.

Учитывая разведение, концентрация перекиси водорода в 1 мл пергидроля будет: 0,00987·25 = 0,2468 г, а концентрация исходного раствора – 24,68 %.

Ход определения. Перед работой полученный 10 %-ный гемолизат разбавляют 25 раз (0,1 мл гемолизата + 2,4 мл воды) и используют в качестве источника фермента.

Инкубационная среда включает 2 мл 0,034 %-ной перекиси водорода и 0,04–0,05 мл 0,1 %-ного гемолизата (объем гемолизата выбирают таким образом, чтобы в пробе содержалось от 20 до 40 мкг гемоглобина). Концентрацию последнего определяют аммиачным методом.

В пробирки разливают по 2 мл перекиси водорода и предварительно инкубируют в течение 5 мин при 25 °С. Затем в каждую пробирку вносят по 0,05 мл гемолизата. В контрольную пробу вместо ферментативного препарата вносят такое же количество воды. Пробы инкубируют в течение 2 мин при 25 °С. По истечении времени реакцию останавливают добавлением 1 мл 4 %-ного раствора молибдата аммония.

Оптическую плотность проб измеряют при длине волны 410 нм в кювете с длиной оптического пути 5 мм против воды. Об активности каталазы судят по степени уменьшения оптической плотности в опытных пробах (Ео) по сравнению с контрольной (Ек): DЕ = Ек – Ео.

Активность фермента (Акат, мкмоль Н2О2/мг Hb/мин) рассчитывают по формуле

,

где 34 – молекулярная масса перекиси водорода; t – время протекания реакции, мин; с – концентрация гемоглобина в пробе, мг; К – коэффициент перевода значений оптической плотности в мг перекиси водорода (рассчитывают по калибровочному графику).

Построение калибровочной кривой. Предварительно готовят 0,1 %-ный раствор перекиси водорода. Затем разбавляют его водой, как указано ниже (табл. 8).

 

Таблица 8. Схема приготовления стандартных растворов перекиси водорода

 

№ пробирки

0,1  %-ный

раствор перекиси водорода, мл

Дистиллированная вода, мл

Концентрация перекиси водорода в 5 мл раствора, мг

1

0,25

4,75

0,25

2

0,5

4,50

0,5

3

1,0

4,0

1,0

4

1,5

3,5

1,5

5

2,0

3,0

2,0

6

2,5

2,5

2,5

 

Из каждой пробирки (№ 1–6) отбирают по 2 мл разбавленного раствора перекиси водорода и переносят в сухие пробирки (№ 1–6). При этом содержание перекиси водорода в пробирках будет: 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 мг. Затем в каждую пробирку вносят 1 мл 4 %-ного раствора молибдата аммония. Пробы инкубируют при 24 °С 10 мин, а затем оптическую плотность измеряют при длине волны 410 нм против воды. По полученным данным строят калибровочную кривую, которую используют в дальнейшем для расчета активности каталазы.

 

Литература

Королюк М.А., Иванова Л.Н., Майорова И.Г., Токарев В.Е. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело. – 1988. – № 1. – С. 16–19.