7.2. Определение активности супероксиддисмутазы

 

7.2.1. Определение активности супероксиддисмутазы в эритроцитах

 

Принцип метода. Метод основан на способности СОД ингибировать процесс восстановления тетразолиевого нитросинего (ТНС) в условиях генерации супероксидного анион-радикала.

Отбор проб и их хранение. Кровь собирают в пробирку с гепарином (200 ед./мл) и центрифугируют при 3000 об./мин в течение 10 мин. Плазму отбирают и хранят на холоде, а эритроциты трижды отмывают физраствором. Отмытые эритроциты гемолизируют. Для этого к 0,3 мл упакованных эритроцитов с помощью пипетки сильной струей приливают 2,7 мл охлажденной бидистиллированной воды. Суспензию периодически встряхивают в течение 5 мин, а затем центрифугируют при 14000 об./мин в течение 20 мин для осаждения стром клеток. Полученный 10 %-ный гемолизат разбавляют до 1 % (0,1 мл гемолизата + 0,9 мл воды). Из разбавленного гемолизата отбирают аликвоту для анализа содержания гемоглобина.

Оборудование. Центрифуга с охлаждением, магнитная мешалка, термостат.

Реактивы и их приготовление. При приготовлении реактивов используют бидистиллированную воду.

1. 0,067 М раствор KH2PO4. В мерной колбе на 1000 мл в дистиллированной воде растворяют 0,907 г KH2PO4.

2. 0,067 М раствор Na2HPO4·2H2O. В мерной колбе на 1000 мл в дистиллированной воде растворяют 11,866 г Na2HPO4·2H2O.

3. 0,067 М фосфатный буфер (pH 7,8). 36 мл 0,067 М раствора KH2PO4 смешивают с 964 мл 0,067 М раствора Na2HPO4·2H2O. Проверяют pH на pH-метре.

4. 26,9 мкМ раствор ЭДТА. 10 мг динатриевой соли ЭДТА растворяют в 100 мл воды. Перед работой исходный раствор разбавляют в 10 раз.

5. 4,04 мМ раствор тетразолиевого нитросинего. 33 мг ТНС растворяют в 10 мл фосфатного буфера. Готовят перед опытом, хранят в темноте на холоде.

6. 65 мкМ раствор феназинметасульфата (ФМС). 2 мг реактива растворяют в 100 мл фосфатного буфера. Хранят в темноте не более недели. В замороженном состоянии в темноте хранится несколько месяцев.

7. 1 мМ раствор НАД·Н. 7,63 мг реактива растворяют в 10 мл фосфатного буфера. Готовят перед опытом и хранят на холоде.

8. 0,9 %-ный раствор хлорида натрия.

9. 96 %-ный этиловый спирт.

10. Желатин.

11. Реактивы для определения гемоглобина аммиачным методом.

12. Реактивы для определения белка по методу Лоури.

Необходимо предварительно определить содержание НАДН в сухих коммерческих препаратах реактива по методу Butler. С этой целью вначале измеряют оптическую плотность раствора трис-ЭДТА без НАДН, а затем добавляют раствор НАДН, содержащий 2 мг НАДН в 1 мл трис-ЭДТА буфера, и снова регистрируют оптическую плотность раствора при длине волны 340 нм. Концентрацию НАДН в мМ рассчитывают по формуле

,

где Ео – оптическая плотность с НАДН; Ек – оптическая плотность трис-ЭДТА буфера; 0,311 – коэффициент молярной экстинкции НАДН.

Ход определения. Для осаждения гемоглобина и частичной очистки СОД к 1 мл 1 %-ного гемолизата добавляют 0,3 мл 96 %-ного этанола и 0,15 мл хлороформа. Смесь перемешивают на магнитной мешалке на холоде 15 мин, затем столько же времени оставляют на холоде, время от времени встряхивая. Хлороформ-этаноловую смесь центрифугируют при 10000 об./мин в течение 15 мин. Отбирают верхний слой и используют в качестве источника фермента. Супернатант должен быть прозрачным или слегка опалесцирующим, без желтого оттенка.

Непосредственно перед определением активности фермента готовят инкубационную смесь следующего состава: 1 мл 26,9 мкМ ЭДТА, 1 мл 4,04 мМ ТНС, 1 мл 65 мкМ ФМС, 1 мг желатина, 26 мл 0,067 М фосфатного буфера (pH 7,8).

В пробирки разливают по 2,85 мл (в случае плазмы 2,7 мл) инкубационной смеси и прогревают их 5 мин при 25°С. Затем в инкубационную смесь добавляют по 0,05 мл супернатанта гемолизата (0,2–0,3 мл супернатанта плазмы) и 0,1 мл 1 мМ НАДН. В контрольную пробу вместо супернатанта вносят 0,1 мл фосфатного буфера. Инкубацию проводят в течение 10 мин в термостате при 25 °С в аэробных условиях в темноте. Реакцию останавливают освещением проб. Оптическую плотность проб измеряют при длине волны 540 нм в кювете с шириной оптического пути 5 мМ против смеси, содержащей все компоненты инкубационной смеси, кроме НАДН.

Расчет активности фермента проводят следующим образом. Вначале определяют процент ингибирования восстановления ТНС (Т, %) за счет СОД по отношению к контрольной пробе по формуле

,

где Ек и Еоп – экстинкции контрольной и опытной проб.

Колебания степени ингибирования ферментативной реакции должны находиться в пределах от 30 до 70 %. Если процент ингибирования за счет СОД выходит за указанные ограничения, необходимо изменять количество вносимого в инкубационную смесь фермента.

За одну условную единицу активности СОД принимают 50-процентное торможение процесса восстановления ТНС за время инкубации.

Активность фермента выражают в условных единицах на мг гемоглобина (мг белка, мл плазмы):

а) гемолизат:

,

где 20 – кратность разведения гемолизата; С – концентрация гемоглобина (мг) в 1 мл 1 %-ного гемолизата;

б) плазма:

,

где С – концентрация белка (мг) в пробе или эквивалентное количество плазмы (мл) в пробе.

 

7.2.2. Определение активности супероксиддисмутазы в мозге

 

Отбор проб и их хранение. Крыс забивают декапитацией. Извлекают головной мозг и на холоде отделяют кору больших полушарий. Из мозга готовят 10 %-ный (1 г ткани + 9 мл среды) гомогенат на физиологическом растворе. Гомогенат центрифугируют при 3000 об./мин (800 g) в течение 10 мин. Супернатант повторно центрифугируют при 14000 об./мин (18000 g) в течение 20 мин. Супернатант сливают и хранят на холоде.

Оборудование. Центрифуга с охлаждением, гомогенизатор с тефлоновым пестиком, магнитная мешалка, термостат, колориметр КФК-3.

Реактивы и их приготовление (см. методику определения активности СОД в эритроцитах).

Ход определения. Для частичной очистки СОД и осаждения балластных белков к 1 мл полученного супернатанта добавляют 0,25 мл 96 %-ного этанола и 0,15 мл хлороформа. Смесь перемешивают 15 мин на магнитной мешалке на холоде. По истечении времени эту смесь на 20 мин оставляют на холоде (0–2°С), время от времени встряхивая. Пробы перемешивают и центрифугируют при 10000 об./мин в течение 15 мин. Верхний слой отбирают и используют в качестве источника фермента.

Непосредственно перед определением активности фермента готовят инкубационную смесь следующего состава: 1 мл 26,9 мкМ ЭДТА, 1 мл 4,04 мкМ ТНС, 1 мл 65 мкМ ФМС, 1 мг желатина, 26 мл 0,067 М фосфатного буфера (рН 7,8).

В пробирки разливают по 2,8 мл инкубационной смеси и выдерживают их 5 мин при 25 °С. Затем в опытные пробы вносят 0,1 мл супернатанта и 0,1 мл 1 мМ НАДН. В контрольную пробу вместо супернатанта вносят 0,1 мл фосфатного буфера. Инкубацию проводят в течение 10 мин в термостате при 25 °С в аэробных условиях в темноте. Реакцию останавливают освещением проб. Оптическую плотность измеряют при длине волны 540 нм в кювете с шириной оптического пути 5 мм против смеси, содержащей все компоненты инкубационной среды, кроме НАДН.

Процесс ингибирования скорости восстановления ТНС (Т, %) СОД рассчитывается по формуле

,

где Ек – экстинкция контрольной пробы; Ео – экстинкция опытной пробы.

За условную единицу активности СОД принимают 50%-ное ингибирование скорости восстановления ТНС за время инкубации.

Активность фермента выражают в условных единицах на мг белка:

Аед / мг белка = ,

где С – концентрация белка в пробе, мг.

 

Литература

1. Дубинина Е.Е., Ефимова Л.Ф., Софронова Л.Н., Геронимус А.Л. Сравнительный анализ активности супероксиддисмутазы и каталазы эритроцитов и цельной крови у новорожденных детей при хронической гипоксии // Лаб. дело. – 1988. – № 8. – С. 16–19.

2. Fried R. Enzymatic and non-enzymatic assay of superoxide dismutase // Biochim. – 1975. – V. 57, № 5. – P. 657–660.