6.8. Определение содержания α-токоферола в сыворотке крови

Принцип метода. Метод основан на измерении флуоресценции α-токоферола, экстрагированного из сыворотки крови гексаном.

Отбор проб и их хранение. Кровь из вены отбирают в сухую пробирку или в пробирку, содержащую 0,1 мл гепарина. Отцентрифугированная сыворотка или плазма может храниться в замороженном виде при – 20°С до 4 мес.

Оборудование. Спектрофлуориметр, центрифуга.

Реактивы и их приготовление.

1. Этиловый спирт 96 %, перегнанный.

2. н-гексан, перегнанный в стеклянной системе.

3. α-токоферол, стандартный раствор 20 мкмоль/л в этиловом спирте. Реактивы хранят в склянках темного стекла.

Ход определения. К 0,3 мл плазмы или сыворотки крови добавляют 1 мл бидистиллированной воды и встряхивают в течение 30 с. После этого добавляют 2 мл этилового спирта для осаждения белков, снова встряхивают и оставляют стоять на 5 мин. Затем добавляют 3 мл н-гексана, энергично встряхивают в течение 1 мин и центрифугируют при 1500 об./мин в течение 2–3 мин. В верхнем гексановом слое измеряют интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения 295 нм и длине волны испускания 323 нм.

В стандартную пробу вместо сыворотки вносят 0,3 мл стандартного раствора α-токоферола, в контрольную пробу – 0,3 мл этанола, дальнейшие процедуры проводят, как в опытных пробах.

Концентрацию экстрагированного из сыворотки крови α-токоферола (С) в мкмоль/л рассчитывают по формуле

,

где Ф_о, Ф_к, Ф_с – интенсивность флуоресценции опытной (сыворотка или плазма), контрольной и стандартной проб соответственно; С_с – концентрация α-токоферола в рабочем стандартном растворе, мкмоль/л.

Литература

Методы исследований в профпатологии / под ред. О.Г. Архиповой. – М., 1988. – 207 с.