6.7.1. Определение суммарного содержания тиоловых групп в сыворотке крови

Принцип метода. Метод основан на способности тиоловых соединений при взаимодействии с 5,5^’-дитио-бис-(2-нитробензойной кислотой) (ДТНБ, реактив Эллмана) образовывать окрашенное соединение – тио-2-нитробензойную кислоту, водный раствор которого имеет максимум поглощения при λ = 412 нм.

Реактивы и их приготовление.

1. 0,01 М фосфатный буфер, рН 7,0.

2. 0,1 М фосфатный буфер, рН 8,0.

3. Реактив Эллмана: готовят маточный раствор путем растворения 39,6 мг ДТНБ в 10 мл 10 мМ фосфатного буфера рН 7,0. Перед определением реактив разводят в 150 раз 100 мМ фосфатным буфером рН 8,0.

Ход определения. К 0,1 мл сыворотки крови добавляют 2,4 мл раствора ДТНБ (соотношение объемов 1:25). Через 30 мин инкубации при комнатной температуре в темноте измеряют оптическую плотность проб при λ = 412 нм против контроля, содержащего вместо сыворотки воду. Параллельно готовят холостую пробу: чтобы исключить мутность раствора, 0,1 мл сыворотки разводят 2,4 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 8,0) в соотношении 1:25.

Расчет производят с учетом коэффициента молярной экстинкции 13×10³ М^–1см^–1 и разведения сыворотки. Для расчета используют разницу оптических плотностей опытной и холостой проб. Результаты выражают в мкмоль/л.

Литература

Соколовский В.В., Кузьмина В.С., Москадынова Г.А., Петрова И.И. Спектрофотометрическое определение тиолов в сыворотке крови // Клинич. лаб. диагностика. – 1997. – № 11. – С. 20–21.