6.7. Определение содержания белковых и низкомолекулярных тиолов

спектрофотометрическим методом

 

В антиоксидантной защите организма важное место принадлежит соотношению SH- и S-S-групп. Существуют различные подходы к изучению тиол-дисульфидного обмена. Один из таких подходов является способ определения общих тиоловых групп и небелковых тиоловых групп с 5,5’-дитио-бис-(2-нитробензойной кислотой), предложенный Эллманом (1959).

 

6.7.1. Определение суммарного содержания тиоловых групп в сыворотке крови

 

Принцип метода. Метод основан на способности тиоловых соединений при взаимодействии с 5,5’-дитио-бис-(2-нитробензойной кислотой) (ДТНБ, реактив Эллмана) образовывать окрашенное соединение – тио-2-нитробензойную кислоту, водный раствор которого имеет максимум поглощения при λ = 412 нм.

Реактивы и их приготовление.

1. 0,01 М фосфатный буфер, рН 7,0.

2. 0,1 М фосфатный буфер, рН 8,0.

3. Реактив Эллмана: готовят маточный раствор путем растворения 39,6 мг ДТНБ в 10 мл 10 мМ фосфатного буфера рН 7,0. Перед определением реактив разводят в 150 раз 100 мМ фосфатным буфером рН 8,0.

Ход определения. К 0,1 мл сыворотки крови добавляют 2,4 мл раствора ДТНБ (соотношение объемов 1:25). Через 30 мин инкубации при комнатной температуре в темноте измеряют оптическую плотность проб при λ = 412 нм против контроля, содержащего вместо сыворотки воду. Параллельно готовят холостую пробу: чтобы исключить мутность раствора, 0,1 мл сыворотки разводят 2,4 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 8,0) в соотношении 1:25.

Расчет производят с учетом коэффициента молярной экстинкции 13×103 М–1см–1 и разведения сыворотки. Для расчета используют разницу оптических плотностей опытной и холостой проб. Результаты выражают в мкмоль/л.

 

Литература

Соколовский В.В., Кузьмина В.С., Москадынова Г.А., Петрова И.И. Спектрофотометрическое определение тиолов в сыворотке крови // Клинич. лаб. диагностика. – 1997. – № 11. – С. 20–21.

 

6.7.2. Определение небелковых тиоловых групп в эритроцитах

 

Реактивы и их приготовление.

1. 20 % раствор сульфосалициловой кислоты.

2. 0,1 М трис-НС1 буфер, рН 8,0, содержащий 0,01 % ЭДТА.

3. Абсолютный метанол.

4. 0,4 % метаноловый раствор ДТНБ (готовят перед определением).

Ход определения. К 0,6 мл гемолизата эритроцитов (1 объем отмытой эритроцитарной взвеси и 10 объемов дистиллированной воды) добавляют 0,2 мл 20 % раствора сульфосалициловой кислоты. Пробы перемешивают и центрифугируют при 3000 об./мин в течение 10 мин при температуре 2 °С. 0,2 мл супернатанта переносят в пробирки, содержащие 2,55 мл трис-буфера с ЭДТА. К полученной смеси добавляют 25 мкл раствора ДТНБ. Измеряют оптическую плотность проб против дистиллированной воды при λ = 412 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Расчёт производят с помощью калибровочной кривой, для построения которой используют растворы восстановленного глутатиона с концентрациями от 0,02 до 2,0 мМ.

Считается, что около 90 % небелковых тиоловых групп эритроцитов принадлежит восстановленному глутатиону, поэтому приведенный здесь метод Эллмана может быть использован для приблизительной оценки уровня глутатиона в эритроцитах.

 

Литература

Медицинские лабораторные технологии: справочник / под ред. А.И. Карпищенко. – СПб.: Интермедика, 1999. – Т. 2. – С. 72–73.