6.6.2. Количественное определение дисульфидных связей в белках

и низкомолекулярных соединениях крови

Принцип метода. Дисульфидные группы восстанавливают сульфитом натрия:

Реакция происходит в присутствии избытка ионов серебра, которые с новыми SH-группами образуют прочную меркаптидную связь, а избыток свободных ионов серебра оттитровывают эквимолярным раствором унитиола.

Отбор проб и их хранение. Плазму крови, гемолизат и мембраны эритроцитов получают по методике определения SH-групп.

Оборудование. Используют то же самое оборудование, что и для титрования SH-групп.

Реактивы и их приготовление. Кроме тех, что используют для титрования SH-групп, необходимы следующие реактивы:

1) 5·10^–4 М раствор унитиола. 0,21 мл 5 %-ного раствора ампулированного препарата разбавляют дистиллированной водой до 100 мл (готовят ежедневно);

2) сульфит натрия, кристаллический порошок.

Ход определения. В ячейку для титрования, содержащую 19 мл 0,01 М аммиачного буфера (рН 9,2), последовательно вносят 0,5 мл 10^–3 М раствора азотнокислого серебра, 0,25 мл плазмы крови (0,1 мл 10 %-ного гемолизата; 0,2 мл суспензии мембран эритроцитов, содержащей 3–4 мг белка на мл) и 2–3 мг сульфита натрия. Смесь постоянно перемешивают на магнитной мешалке с заданной скоростью. Обратное титрование проводят 5·10^–4 М раствором унитиола, добавляя его по 0,05 мл, после того, как показание регистрирующего прибора будет стабильным. По точке эквивалентности вычисляют суммарное количество тиоловых групп (свободные SH-группы + SH-группы, образующиеся после восстановления дисульфидных связей).

При определении количества свободных SH-групп титрование биоматериала производят в тех же условиях, но в отсутствие сульфита натрия. Содержание тиоловых групп выражают в мкмолях на 100 мл плазмы или упакованных эритроцитов (в случае гемолизата), а также на мг белка (в случае мембран эритроцитов), используя следующие выражения:

плазма крови:

,

где С – концентрация тиоловых групп в мкмоль/100 мл плазмы; DV – разность между объемом азотнокислого серебра, содержащегося в пробе (0,5 мл), и объемом унитиола, израсходованного на титрование; 0,25 – количество плазмы, использованное для анализа, мл;

гемолизат:

где m – разведение пробы при приготовлении гемолизата; 0,1 – количество гемолизата, использованное для анализа, мл;

мембраны эритроцитов:

,

где К – количество белка в пробе для анализа, мг.

Содержание дисульфидных связей рассчитывают по разности между количеством SH-групп, обнаруженных в присутствии и отсутствие сульфита натрия.

Литература

Соколовский В.В., Белазерова Л.А., Огурцова Р.Е. Метод количественного определения дисульфидных групп крови обратным амперометрическим титрованием // Лаб. дело. – 1977. – № 1. – С. 26–28.