6.4. Определение антиокислительной активности

 

6.4.1. Определение антиокислительной активности гидрофильных компонентов плазмы крови

 

Принцип метода. Метод основан на регистрации скорости окисления восстановленной формы 2,6-дихлорфенолиндофенола (2,6-ДХФИФ) кислородом, растворенным в реакционной среде при наличии и отсутствии биологического материала. При этом бесцветная лейкоформа 2,6-ДХФИФ переходит в окрашенную форму, имеющую максимум поглощения при 600 нм. Константа ингибирования биологическим материалом окисления 2,6-ДХФИФ служит показателем антиокислительной активности биологического материала. Выбор данного субстрата обусловлен тем, что его окислительно-восстановительный потенциал (0,22 В при pH 7,9) позволяет быстро и количественно переводить его из окисленной формы в восстановленную в присутствии сульфата двухвалентного железа. Кроме того, 2,6-ДХФИФ способен окисляться кислородом воздуха с удобной для регистрации скоростью в стационарных условиях.

Реактивы и их приготовление.

1. 0,25 М фосфатный буфер, рН 7,4. 7,8 г NaH2PO4×2H2O растворяют в 100 мл дистиллированной воды и 11,4 г К2НРO4×3Н2O – в 100 мл дистиллированной воды. К 81 мл второго раствора приливают 19 мл первого раствора и устанавливают нужное значение рН с помощью рН-метра. Затем раствор доводят до 200 мл дистиллированной водой.

2. 0,8 мМ водный раствор 2,6-ДХФИФ в окисленной форме. Для этого 11,6 мг 2,6-дихлорфенолиндофенола растворяют в 50 мл дистиллированной воды. Раствор готовят непосредственно перед анализами.

3. 3,2 мМ раствор закисного сернокислого железа. 44,5 г FeSO4×7Н2O растворяют в 50 мл дистиллированной воды. Раствор готовят непосредственно перед анализами.

Оборудование. Cпектрофотометр с термостатируемой кюветой или спектрофотометр «Спекол» с термостатируемой кюветой; ультратермостат; баня водяная; весы аналитические; колбы мерные; пипетки измерительные; микропипетки на 10 и 20 мкл.

Ход определения. В термостатируемую кювету последовательно добавляют 0,5 мл фосфатного буфера (рН 7,4), 0,15 мл раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, 0,15 мл раствора закисного сернокислого железа и быстро перемешивают. Все растворы должны иметь температуру 37 ºС. Сразу после перемешивания быстро добавляют 10 или 20 мкл плазмы крови (опыт) или воды (контроль), перемешивают и через каждые 30 с после добавления плазмы или воды на протяжении 5 мин измеряют оптическую плотность при 600 нм против воды (Don, Dк).

Определяют оптическую плотность при 600 нм инкубационной среды, в которой 2,6-ДХФИФ окислен полностью. Для этого в кювету добавляют те же компоненты, но вместо раствора FеSO4 и пробы добавляют равные им объемы дистиллированной воды (Dmax).

Расчет результатов начинают с определения констант скоростей окисления 2,6-ДХФИФ в контроле (Кк) и опыте (Коп) по формулам:

 и ,

где ln – логарифм натуральный (положительный).

Рассчитывают константу ингибирования и) плазмой крови окисления 2,6-ДХФИФ, являющуюся показателем ее антиокислительной активности по формуле

,

где Киантиокислительная активность плазмы крови, мл·мин–1; Ккконстанта скорости окисления 2,6-ДХФИФ в контроле; Коп – константа скорости окисления 2,6-ДХФИФ в опыте; Сконцентрация плазмы в инкубационной смеси, мг/л.

Примечания: 1) плазма крови должна быть без гемолиза; 2) исследование должно проводиться не позднее 6 ч после взятия крови.

 

6.4.2. Определение антиокислительной активности гидрофильных компонентов головного мозга

 

Определение антиокислительной активности гидрофильных компонентов головного мозга производят так же, как и плазмы крови, в соответствии с методом В.Л. Семенова и А.М. Ярош (1985). Различия заключаются в следующем. Из выбранного отдела головного мозга готовят 10 %-ный гомогенат на 0,9 %-ном растворе хлорида натрия. Гомогенат центрифугируют при 3000 об./мин в течение 10 мин. Супернатант отбирают и разводят 0,9 %-ным раствором хлорида натрия в соотношении 1:10 и используют для анализа.

Константу ингибирования (Ки) гомогенатом мозга окисления субстрата вычисляют из следующего выражения:

,

где Киантиокислительная активность гомогената мозга, мг мин–1; Ккконстанта скорости окисления 2,6-ДХФИФ в контроле; Коп – константа скорости окисления 2,6-ДХФИФ в опыте; Сконцентрация ткани мозга в инкубационной смеси, мг/л.

Литература

Семенов В.Л., Ярош А.М. Метод определения антиокислительной активности биологического материала // Укр. биохим. журнал. – 1985. – Т. 57, № 3. – С. 50–52.