6.4.
Определение антиокислительной активности
6.4.1. Определение
антиокислительной активности гидрофильных компонентов плазмы крови
Принцип метода. Метод основан на регистрации скорости окисления
восстановленной формы 2,6-дихлорфенолиндофенола (2,6-ДХФИФ) кислородом,
растворенным в реакционной среде при наличии и отсутствии биологического
материала. При этом бесцветная лейкоформа
2,6-ДХФИФ переходит в окрашенную форму, имеющую максимум поглощения при 600 нм. Константа ингибирования биологическим материалом
окисления 2,6-ДХФИФ служит показателем антиокислительной активности
биологического материала. Выбор данного субстрата обусловлен тем, что его окислительно-восстановительный потенциал (0,22 В при pH 7,9)
позволяет быстро и количественно переводить его из окисленной формы в
восстановленную в присутствии сульфата двухвалентного железа. Кроме того,
2,6-ДХФИФ способен окисляться кислородом воздуха с
удобной для регистрации скоростью в стационарных условиях.
Реактивы и их
приготовление.
1.
2.
0,8 мМ водный раствор 2,6-ДХФИФ в окисленной форме.
Для этого 11,6 мг 2,6-дихлорфенолиндофенола растворяют в 50 мл дистиллированной
воды. Раствор готовят непосредственно перед анализами.
3.
3,2 мМ раствор закисного сернокислого железа. 44,5 г FeSO4×7Н2O растворяют в 50 мл дистиллированной воды. Раствор
готовят непосредственно перед анализами.
Оборудование. Cпектрофотометр с термостатируемой кюветой
или спектрофотометр «Спекол» с термостатируемой
кюветой; ультратермостат; баня водяная; весы
аналитические; колбы мерные; пипетки измерительные; микропипетки на 10 и 20 мкл.
Ход определения. В термостатируемую кювету
последовательно добавляют 0,5 мл фосфатного буфера (рН 7,4), 0,15 мл раствора
2,6-дихлорфенолиндофенола, 0,15 мл раствора закисного сернокислого железа и
быстро перемешивают. Все растворы должны иметь температуру 37 ºС. Сразу
после перемешивания быстро добавляют 10 или 20 мкл
плазмы крови (опыт) или воды (контроль), перемешивают и через каждые 30 с после
добавления плазмы или воды на протяжении 5 мин измеряют оптическую плотность
при 600 нм против воды (Don, Dк).
Определяют
оптическую плотность при 600 нм инкубационной среды,
в которой 2,6-ДХФИФ окислен полностью. Для этого в кювету добавляют те же
компоненты, но вместо раствора FеSO4 и пробы
добавляют равные им объемы дистиллированной воды (Dmax).
Расчет
результатов начинают с определения констант скоростей окисления 2,6-ДХФИФ в
контроле (Кк)
и опыте (Коп) по формулам:
и 
,
где
ln – логарифм натуральный (положительный).
Рассчитывают
константу ингибирования (Ки) плазмой крови окисления
2,6-ДХФИФ, являющуюся показателем ее антиокислительной активности по формуле
,
где Ки
– антиокислительная активность плазмы крови, мл·мин–1;
Кк – константа скорости
окисления 2,6-ДХФИФ в контроле; Коп
– константа скорости окисления 2,6-ДХФИФ в опыте; С – концентрация
плазмы в инкубационной смеси, мг/л.
Примечания: 1) плазма крови должна быть без гемолиза; 2)
исследование должно проводиться не позднее 6 ч после взятия крови.
6.4.2. Определение антиокислительной активности гидрофильных компонентов
головного мозга
Определение
антиокислительной активности гидрофильных компонентов головного мозга
производят так же, как и плазмы крови, в соответствии с методом В.Л. Семенова и
А.М. Ярош (1985). Различия заключаются в следующем.
Из выбранного отдела головного мозга готовят 10 %-ный
гомогенат на 0,9 %-ном растворе хлорида натрия. Гомогенат центрифугируют при 3000 об./мин в течение 10 мин. Супернатант
отбирают и разводят 0,9 %-ным раствором хлорида
натрия в соотношении 1:10 и используют для анализа.
Константу
ингибирования (Ки) гомогенатом
мозга окисления субстрата вычисляют из следующего выражения:
,
где Ки – антиокислительная
активность гомогената мозга, мг мин–1;
Кк – константа скорости
окисления 2,6-ДХФИФ в контроле; Коп
– константа скорости окисления 2,6-ДХФИФ в опыте; С – концентрация
ткани мозга в инкубационной смеси, мг/л.
Литература
Семенов В.Л., Ярош А.М. Метод определения антиокислительной
активности биологического материала // Укр. биохим. журнал. – 1985. – Т. 57, № 3. – С. 50–52.