6.3. Определение общей антиокислительной активности

6.3.1. Определение общей антиокислительной активности плазмы крови

Принцип метода. Ненасыщенные жирные кислоты подвергаются перекисному окислению в присутствии ионов двухвалентного железа. Об интенсивности перекисного окисления судят по накоплению в среде инкубации МДА. По степени торможения накопления МДА в присутствии плазмы крови судят о ее суммарной АОА.

Оборудование. Центрифуга с охлаждением, термостат, электроплитка, фотоэлектроколориметр типа КФК-3 или спектрофотометр СФ-46, магнитная мешалка.

Реактивы и их приготовление.

1. Суспензия линоленовой кислоты. К 1 мл дистиллированной воды (37 °С) добавляют 50 мкл тритона Х-100, после перемешивания добавляют 10 мкл линоленовой кислоты. Хорошо перемешивают и переносят в стаканчик с 24 мл дистиллированной воды. Суспензию постоянно перемешивают на магнитной мешалке. Готовят каждый день.

2. 1 мМ раствор сульфата железа (II). 27,8 мг соли растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

3. 0,8 %-ный раствор тиобарбитуровой кислоты. Объем приготовляемого раствора ТБК зависит от количества проб. 80 мг ТБК при нагревании (60–70 °С) растворяют в 10 мл дистиллированной воды. Раствор готовят перед опытом.

4. 0,9 %-ный раствор хлорида натрия.

5. 1 %-ный раствор фосфорной кислоты. 3,4 мл концентрированной кислоты (плотность 1,705 г/мл) разбавляют дистиллированной водой до 500 мл.

6. Бутанол.

Ход определения. Отобранную плазму крови разводят, для чего к 0,1 мл плазмы добавляют 0,3 мл физиологического раствора.

Для определения общей АОА используют две пробы: контрольную (без плазмы крови) и опытную (с плазмой крови). С этой целью в 2 пробирки помещают 0,5 мл суспензии линоленовой кислоты, 0,1 мл 1 мМ раствора сульфата железа. В опытную пробу добавляют 0,01 мл разведенной плазмы крови, а в контрольную – 0,01 мл физиологического раствора. Параллельно ставят контрольные пробы, где вместо линоленовой кислоты берут 0,5 мл дистиллированной воды. Все пробы инкубируют в течение 1 ч при 37 °С, постоянно перемешивая.

Накопление в среде инкубации МДА устанавливают с помощью ТБК (Андреева и др., 1988). Для этого по окончании инкубации из каждой пробы отбирают 0,2 мл, добавляют 3 мл 1 %-ной фосфорной кислоты и после перемешивания добавляют 1 мл 0,8 % раствора ТБК. Пробы хорошо перемешивают и ставят в кипящую водяную баню на 1 ч, затем охлаждают до комнатной температуры. В каждую пробирку добавляют 4 мл бутанола, тщательно перемешивают и для разделения фаз центрифугируют 10 мин при 3000 об./мин. Измеряют оптическую плотность верхней бутанольной фазы при длине волны 515 и 532 нм против контрольной пробы. В расчет берут разность экстинкций: DЕ = Е₅₃₂ – Е₅₁₅.

АОА вычисляют в процентах по формуле, где за 100 % принимается активность такого антиоксиданта, который полностью подавляет образование МДА в опытной пробе за 1 ч инкубации:

^,

где [МДА_оп] – содержание МДА (в единицах экстинкции) в опытной пробе с добавкой плазмы крови; [МДА_к] – содержание МДА в контроле без биоматериала соответственно в начальный момент времени (0¢) и после инкубации (60¢).