5.4. Определение окислительной модификации белков в тканях

Реактивы и их приготовление.

1. Гомогенизирующий буфер: 50 мМ фосфатный буфер, рН 7,4, содержащий 0,1 % дигитонина, коктейль антипротеаз (40 мкг/мл фенилметилсульфонилфлуорида, 5 мкг/мл лейпептина, 7 мкг/мл пепстатина, 5 мкг/мл апротонина) и 1 мМ ЭДТА.

2. 10 % раствор стрептомицина сульфата в 50 мМ фосфатном буфере.

3. 2,5 М раствор HCl.

4. 10 мМ раствор 2,4-динитрофенилгидразина в 2,5 М HCl.

5. 20 % раствор ТХУ.

6. 10 % раствор ТХУ.

7. Смесь этанол-этилацетат (1:1).

8. 6 М раствор гуанидингидрохлорида, содержащий 20 мМ фосфат калия, рН доводят до 2,3 концентрированной HCl.

Ход определения. Приготовление гомогената. 300 мг ткани гомогенизируют в 6 мл гомогенизирующего буфера. Гомогенат инкубируют 15 мин при комнатной температуре, а затем центрифугируют при 6000 g в течение 10 мин. Измеряют абсорбцию супернатанта при 280 и 260 нм. Если отношение 280/260 < 1, приступают к удалению нуклеиновых кислот при помощи стрептомицина сульфата.

Удаление нуклеиновых кислот. При работе с тканевыми гомогенатами необходимо дополнительно провести осаждение присутствующих в тканях нуклеиновых кислот, которые могут заведомо ошибочно повышать уровень карбонильных производных белкового происхождения. Осаждение нуклеиновых кислот осуществляется с помощью 10 % раствора стрептомицина сульфата в 50 мМ HEPES (рН 7,2). К 1 объему раствора стрептомицина сульфата добавляют 9 объемов тканевого гомогената, концентрация белка в котором должна быть не более чем 5 мг/мл, и оставляют на 15 мин при комнатной температуре. Затем центрифугируют при 6000 g в течение 10 мин и используют для работы надосадочную жидкость.

Реакция с 2,4-динитрофенилгидразином. В две стеклянные пробирки вносят по 1 мл экстракта белков (около 0,7–1,0 мг). В опытную пробу приливают 4 мл 10 мМ ДНФГ в 2,5 М HCl, в контрольную – то же количество 2,5 М HCl. Пробы оставляют при комнатной температуре в течение 1 часа в темноте, периодически встряхивая каждые 10–15 мин. Затем в обе пробы добавляют по 5 мл 20 % ТХУ, выдерживают на льду в течение 10 мин. Для осаждения белков пробы центрифугируют при 11000 g, надосадочную жидкость сливают. Осадки ресуспендируют в 4 мл 10 % ТХУ и снова осаждают при тех же условиях. Осадки трижды промывают 3 мл смеси этанола c этилацетатом (1:1) с целью удаления непрореагировавщего 2,4-ДНФГ и примесей липидов. Конечные осадки растворяют в 2 мл 6 М гуанидингидрохлорида и оставляют на 10 мин при 37°С, перемешивая. Нерастворимые частицы удаляют дополнительным центрифугированием.

Количество образовавшихся 2,4-ДНФГ-гидразонов регистрируют при длине волны 370 нм против контрольной пробы. Для расчета используют коэффициент молярной экстинкции 22000 М^–1см^–1.

Содержание белка в пробах определяют по спектрофотометрическому методу. Для этого осадки, полученные в контрольной пробе (содержащие 2,5 М HCl), растворяют в 6 М гуанидингидрохлориде и оптическую плотность измеряют при длине волны 280 нм. Содержание белка рассчитывается по калибровочному графику, построенному по бычьему сывороточному альбумину (концентрация 0,25–2,0 мг/мл), растворенному в 6 М гуанидингидрохлориде. Оптическая плотность измеряется при 280 нм.

Содержание карбонилов, выраженное в нмолях на мг белка расчитывают по формуле:

,

где DE = E_on – E_к; С – содержание белка в пробе; 10⁶ – коэффициент перевода на нмоли.

Литература

Reznick A.Z., Packer L. Oxidative damage to proteins: spectrophotometric method for carbonyl assay // Methods Enzymol. – 1994. – V. 233. – P. 357–363.