5.3. Определение окислительной модификации мембранных белков эритроцитов

Отбор проб и их хранение. В опытах используют суспензию мембран эритроцитов.

Реактивы и их приготовление.

1. 1 мМ раствор сульфата железа (II).

2. 1 мМ раствор ЭДТА.

3. 0,1 мМ раствор перекиси водорода.

4. 20 %-ный раствор ТХУ.

5. 10 %-ный раствор ТХУ.

6. 0,1 н. раствор гидроксида натрия.

7. 10 мМ раствор 2,4-ДНФГ.

8. 2 н. раствор соляной кислоты.

9. 6 М раствор гуанидингидрохлорида.

10. Этилацетат.

11. 96 %-ный этиловый спирт.

12. Реактивы для определения белка по методу Лоури.

Все реактивы готовят на бидистиллированной воде.

Ход определения. Исследуют исходное содержание карбонильных групп в мембранных белках эритроцитов, а также интенсивность этого процесса в инкубируемых пробах в присутствии Fe²⁺–H₂O₂.

Пробы предварительно осаждают 20 %-ным раствором ТХУ и центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают, и осадок мембранных белков растворяют в 0,1 мл 0,1 н. NaOH в течение 5 минут.

При определении исходного уровня карбонильных групп белков в опытную пробирку вносят суспендированный осадок мембран эритроцитов, содержащий примерно 0,33 мг белка, 1 мл 10 мМ 2,4-ДНФГ и 1 мл 20 %-го раствора ТХУ. В контрольную пробирку вносят те же компоненты, кроме 2,4-ДНФГ, вместо него вносили 1 мл 2 н. HCl.

При определении карбонильных групп белков, стимулированных системой Fe²⁺–H₂O₂, в пробирку вносят суспендированный осадок мембран эритроцитов, содержащий примерно 0,33 мг белка, 0,1 мл смеси 1 мМ ЭДТА и 1 мМ сульфата железа (1:1, готовят перед опытом) и 0,1 мл 0,1 мМ H₂O₂. Пробы инкубируют 15 мин при 37 ºС. Затем в опытную пробирку добавляют 1 мл 10 мМ 2,4-ДНФГ и 1 мл 20 %-ного раствора ТХУ. В контрольную пробирку вместо 2,4-ДНФГ вносят такой же объем 2 н. соляной кислоты.

Все пробы после добавления ТХУ оставляют на 1 час при комнатной температуре, перемешивая каждые 15 мин. По истечении времени пробы центрифугируют при 3000 об./мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадки промывают 2 раза – 4 мл смеси этилацетат-этиловый спирт (1:1) и 1 раз 4 мл 10 %-ного раствора ТХУ для отмывания белков от несвязавшегося ДНФГ и липидов.

Промытые осадки высушивают либо в сушильном шкафу при 40 ºС, либо помещением пробирок в холодильник на ночь без крышек.

Высушенные осадки растворяют в 3 мл 6 М раствора гуанидингидрохлорида. Пробы перемешивают и оставляют на 30 минут. Содержание белка в контрольной пробе определяют спектрофотометрически при длине волны 280 нм. Уровень карбонильных групп, измеренный по поглощению при 370 нм против контрольной пробы, рассчитывают, используя коэффициент молярной экстинкции, равный 22000 М^–1·см^–1 для ДНФГ-производных.

,

где Х= содержание фенилгидразонов в нмолях на 1 мг белка; С – содержание белка в пробе, мг; 10⁶ – кофициент пересчета на нмоли.

Литература

1. Дубинина Е.Е., Леонова Н.В., Зыбина Н.Н., и др. Окислительная деструкция белков, особенности окислительной модификации белков с использованием модельных систем и в плазме крови пожилых людей с деменциями // Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии: Труды конф. – СПб.: Изд-во СПбГМУ, 1998. – Т. 2. – С. 425–429.

2. Levine R.L., Garlana D., Oliver C.N., etc. Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins // Methods in Enzymol. – 1990. – V. 186. – P. 464–478.

3. Nyström T. Role of oxidative carbonylation in protein quality control and senescence // EMBO J. – 2005. – V. 24. – P. 1311–1317.

4. Venditti P., Rosa R.D., Meo S.D. Effect of cold-induced hyperthyriodism on H2O2 production and susceptibility of stress conditions of rat liver mitochondria // Free Rad. Biol. Med. – 2004. – V. 36, № 3. – P. 348–358.