5.3. Определение окислительной модификации мембранных белков эритроцитов

 

Отбор проб и их хранение. В опытах используют суспензию мембран эритроцитов.

Реактивы и их приготовление.

1. 1 мМ раствор сульфата железа (II).

2. 1 мМ раствор ЭДТА.

3. 0,1 мМ раствор перекиси водорода.

4. 20 %-ный раствор ТХУ.

5. 10 %-ный раствор ТХУ.

6. 0,1 н. раствор гидроксида натрия.

7. 10 мМ раствор 2,4-ДНФГ.

8. 2 н. раствор соляной кислоты.

9. 6 М раствор гуанидингидрохлорида.

10. Этилацетат.

11. 96 %-ный этиловый спирт.

12. Реактивы для определения белка по методу Лоури.

Все реактивы готовят на бидистиллированной воде.

Ход определения. Исследуют исходное содержание карбонильных групп в мембранных белках эритроцитов, а также интенсивность этого процесса в инкубируемых пробах в присутствии Fe2+H2O2.

Пробы предварительно осаждают 20 %-ным раствором ТХУ и центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают, и осадок мембранных белков растворяют в 0,1 мл 0,1 н. NaOH в течение 5 минут.

При определении исходного уровня карбонильных групп белков в опытную пробирку вносят суспендированный осадок мембран эритроцитов, содержащий примерно 0,33 мг белка, 1 мл 10 мМ 2,4-ДНФГ и 1 мл 20 %-го раствора ТХУ. В контрольную пробирку вносят те же компоненты, кроме 2,4-ДНФГ, вместо него вносили 1 мл 2 н. HCl.

При определении карбонильных групп белков, стимулированных системой Fe2+H2O2, в пробирку вносят суспендированный осадок мембран эритроцитов, содержащий примерно 0,33 мг белка, 0,1 мл смеси 1 мМ ЭДТА и 1 мМ сульфата железа (1:1, готовят перед опытом) и 0,1 мл 0,1 мМ H2O2. Пробы инкубируют 15 мин при 37 ºС. Затем в опытную пробирку добавляют 1 мл 10 мМ 2,4-ДНФГ и 1 мл 20 %-ного раствора ТХУ. В контрольную пробирку вместо 2,4-ДНФГ вносят такой же объем 2 н. соляной кислоты.

Все пробы после добавления ТХУ оставляют на 1 час при комнатной температуре, перемешивая каждые 15 мин. По истечении времени пробы центрифугируют при 3000 об./мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадки промывают 2 раза – 4 мл смеси этилацетат-этиловый спирт (1:1) и 1 раз 4 мл 10 %-ного раствора ТХУ для отмывания белков от несвязавшегося ДНФГ и липидов.

Промытые осадки высушивают либо в сушильном шкафу при 40 ºС, либо помещением пробирок в холодильник на ночь без крышек.

Высушенные осадки растворяют в 3 мл 6 М раствора гуанидингидрохлорида. Пробы перемешивают и оставляют на 30 минут. Содержание белка в контрольной пробе определяют спектрофотометрически при длине волны 280 нм. Уровень карбонильных групп, измеренный по поглощению при 370 нм против контрольной пробы, рассчитывают, используя коэффициент молярной экстинкции, равный 22000 М–1·см–1 для ДНФГ-производных.

,

где Х= содержание фенилгидразонов в нмолях на 1 мг белка; С – содержание белка в пробе, мг; 106  – кофициент пересчета на нмоли.

 

Литература

1. Дубинина Е.Е., Леонова Н.В., Зыбина Н.Н., и др. Окислительная деструкция белков, особенности окислительной модификации белков с использованием модельных систем и в плазме крови пожилых людей с деменциями // Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии: Труды конф. – СПб.: Изд-во СПбГМУ, 1998. – Т. 2. – С. 425–429.

2. Levine R.L., Garlana D., Oliver C.N., etc. Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins // Methods in Enzymol. – 1990. – V. 186. – P. 464–478.

3. Nyström T. Role of oxidative carbonylation in protein quality control and senescence // EMBO J. – 2005. – V. 24. – P. 1311–1317.

4. Venditti P., Rosa R.D., Meo S.D. Effect of cold-induced hyperthyriodism on H2O2 production and susceptibility of stress conditions of rat liver mitochondria // Free Rad. Biol. Med. – 2004. – V. 36, № 3. – P. 348–358.