4.6. Определение интенсивности процессов перекисного окисления липидов

в гомогенатах головного мозга

 

Принцип метода. Об интенсивности перекисного окисления липидов судят по накоплению в среде инкубации одного из промежуточных продуктов – МДА.

Отбор проб и их хранение. Из больших полушарий головного мозга (или другого отдела мозга) на 0,1 М трис-HCl буфере (рН 7,4 при 37 °С), готовят 10 %-ный гомогенат. Полученный гомогенат фильтруют через 2 слоя нейлоновой ткани или центрифугируют при 1500 об./мин в течение 10 мин. Фильтрат или супернатант хранят на холоде.

Оборудование. Гомогенизатор с тефлоновым пестиком, низкоскоростная центрифуга с охлаждением, спектрофотометр.

Реактивы и их приготовление.

1. 0,1 М трис-HCl буфер (рН 7,4 при 37 °С). 6,057 г триса растворяют в 450 мл дистиллированной воды и 1 н. HCl рН доводят до 7,4 при 37 °С. Общий объем водой доводят до 500 мл.

2. 40 мМ раствор НАДФН. 33 мг тетранатриевой соли НАДФН растворяют в 1 мл 0,1 М трис-HCl буфера.

3. 160 мМ раствор АДФ. 75,4 мг динатриевой соли АДФ растворяют в 1 мл 0,1 М трис-HCl буфера.

4. 0,479 мМ раствор соли Мора. 9,4 мг соли (NH4)Fe(SO4)2·6H2O растворяют в 50 мл 0,1 М трис-HCl буфера.

5. 20 мМ раствор аскорбиновой кислоты. 7 мг кислоты растворяют в 2 мл 0,1 М трис-HCl буфера.

6. 0,75 %-ный раствор ТБК. Готовят при небольшом нагревании на дистиллированной воде.

7. 30 %-ный раствор ТХУ.

Растворы НАДФН, АДФ, аскорбиновой кислоты и ТБК готовят ежедневно перед работой и хранят на холоде.

Ход определения. Исследуют исходный уровень ПОЛ, а также интенсивность процессов ПОЛ в инкубируемых пробах в отсутствие прооксидантов (для определения спонтанного ПОЛ), в присутствии НАДФН (ферментативный ПОЛ) и Fe2+ + аскорбата (неферментативный ПОЛ). При определении НАДФН-зависимого ПОЛ среда инкубации содержит 0,1 М трис-HCl буфер (рН 7,4 при 37 °С), 1 мМ НАДФН, 4 мМ АДФ и 12 мкМ соль Мора, а при аскорбат-зависимом ПОЛ – 0,1 М трис-HCl буфер (рН 7,4 при 37 °С), 0,5 мМ аскорбат и 12 мкМ соль Мора.

Для работы берут 12 пробирок по 3 на каждый анализ (из них 1 контрольная и 2 опытные). В пробирки наливают растворы в соответствии с табл. 3.

 

Таблица 3. Последовательность смешивания растворов (мл)

для определения интенсивности процессов ПОЛ в мозге

 

Раствор

ПОЛ

Исходный уровень

Спонтанный

НАДФН-зависимый

Аскорбат-зависимый

1

 

0,1 М трис-HCl

буфер (рН 7,4)

 

3,8

 

3,8

 

3,5

 

3,6

2

40 мМ НАДФН

-

-

0,1

-

3

0,16 мМ АДФ

-

-

0,1

-

4

0,48 мМ соль Мора

-

-

0,1

0,1

5

20 мМ аскорбат

-

-

-

0,1

6

Гомогенат

0,2

0,2

0,2

0,2

7

30 % ТХУ

2,0

2,0

2,0

2,0

8

0,75 % ТБК

2,0

2,0

2,0

2,0

 

При исследовании исходного уровня ПОЛ в ткани мозга к среде, содержащей 3,8 мл 0,1 М трис-HCl буфера и 2,0 мл 30 %-ного раствора ТХУ, добавляют 0,2 мл гомогената и после перемешивания пробы сразу прогревают 15 мин на кипящей водяной бане.

При определении скорости спонтанного НАДФН- и аскорбат-зависимого ПОЛ пробы после добавления соответствующих реактивов и гомогената инкубируют 10 мин при 37 °С. По истечении времени в каждую пробу добавляют 2 мл 30 %-ного раствора холодного ТХУ, тщательно перемешивают. Затем добавляют 2 мл 0,75 %-ного раствора ТБК, перемешивают и ставят на 15 мин в кипящую водяную баню. Пробы охлаждают и центрифугируют при 4000 об./мин в течение 10 мин. В надосадочной жидкости определяют оптическую плотность при длине волны 532 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм против слепой пробы, содержащей 4 мл 0,1 М трис-HCl буфера, 2 мл 30 %-ного раствора ТХУ и 2 мл 0,75 %-ного раствора ТБК и проведенной через вышеописанные процедуры.

Расчет содержания МДА (нмоль/г ткани) в мозге производят по следующей формуле:

,

где Е – оптическая плотность; V – конечный объем пробы (8 мл); 1,56·105 – коэффициент молярной экстинкции; С – навеска ткани (г).

О скорости неиндуцированных (спонтанных) и индуцированных прооксидантами (НАДФН- и аскорбат-зависимых) процессов пероксидации липидов тканей мозга судят по разности количества МДА до и после 10 мин инкубации.

 

Литература

Лемешко В.В., Никитченко Ю.В., Свич И.В., Овсянников С.Е. Перекисное окисление липидов биомембран и его ферментативная регуляция при старении крыс // Укр. биохим. журн. – 1987. – Т. 59, № 2. – С. 50–57.