4.6. Определение интенсивности процессов перекисного окисления липидов
в гомогенатах головного мозга
Принцип метода. Об интенсивности перекисного окисления липидов судят по
накоплению в среде инкубации одного из промежуточных продуктов – МДА.
Отбор проб и их хранение. Из больших полушарий головного мозга
(или другого отдела мозга) на
Оборудование. Гомогенизатор с тефлоновым пестиком,
низкоскоростная центрифуга с охлаждением, спектрофотометр.
Реактивы и их приготовление.
1.
2. 40 мМ раствор НАДФН. 33 мг тетранатриевой
соли НАДФН растворяют в 1 мл 0,1 М трис-HCl буфера.
3. 160 мМ раствор АДФ. 75,4 мг динатриевой
соли АДФ растворяют в 1 мл 0,1 М трис-HCl буфера.
4. 0,479 мМ раствор соли Мора. 9,4 мг соли (NH4)Fe(SO4)2·6H2O растворяют в 50 мл 0,1 М трис-HCl буфера.
5. 20 мМ раствор аскорбиновой кислоты. 7 мг кислоты растворяют в
2 мл 0,1 М трис-HCl буфера.
6. 0,75 %-ный раствор ТБК. Готовят при небольшом нагревании на
дистиллированной воде.
7. 30 %-ный раствор ТХУ.
Растворы
НАДФН, АДФ, аскорбиновой кислоты и ТБК готовят ежедневно перед работой и хранят
на холоде.
Ход определения. Исследуют исходный уровень ПОЛ, а
также интенсивность процессов ПОЛ в инкубируемых пробах в отсутствие прооксидантов (для определения спонтанного ПОЛ), в
присутствии НАДФН (ферментативный ПОЛ) и Fe2+ + аскорбата
(неферментативный ПОЛ). При определении
НАДФН-зависимого ПОЛ среда инкубации содержит 0,1 М трис-HCl буфер (рН 7,4 при 37 °С), 1 мМ НАДФН, 4 мМ АДФ и 12 мкМ соль Мора, а при аскорбат-зависимом
ПОЛ – 0,1 М трис-HCl буфер (рН 7,4 при 37 °С), 0,5 мМ аскорбат и 12 мкМ соль Мора.
Для работы
берут 12 пробирок по 3 на каждый анализ (из них 1 контрольная
и 2 опытные). В пробирки наливают растворы в соответствии с табл. 3.
Таблица 3. Последовательность
смешивания растворов (мл)
для определения интенсивности процессов ПОЛ в мозге
№ |
Раствор |
ПОЛ |
|||
Исходный уровень |
Спонтанный |
НАДФН-зависимый |
Аскорбат-зависимый |
||
1 |
буфер (рН 7,4) |
3,8 |
3,8 |
3,5 |
3,6 |
2 |
40 мМ НАДФН |
- |
- |
0,1 |
- |
3 |
0,16 мМ АДФ |
- |
- |
0,1 |
- |
4 |
0,48 мМ
соль Мора |
- |
- |
0,1 |
0,1 |
5 |
20 мМ аскорбат |
- |
- |
- |
0,1 |
6 |
Гомогенат |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
7 |
30 % ТХУ |
2,0 |
2,0 |
2,0 |
2,0 |
8 |
0,75 % ТБК |
2,0 |
2,0 |
2,0 |
2,0 |
При
исследовании исходного уровня ПОЛ в ткани мозга к среде, содержащей 3,8 мл 0,1
М трис-HCl буфера и 2,0 мл 30 %-ного раствора ТХУ, добавляют 0,2 мл гомогената
и после перемешивания пробы сразу прогревают 15 мин на кипящей водяной бане.
При определении скорости спонтанного НАДФН- и аскорбат-зависимого ПОЛ пробы после добавления
соответствующих реактивов и гомогената инкубируют 10
мин при 37 °С. По истечении времени в каждую пробу добавляют 2 мл 30 %-ного раствора холодного ТХУ, тщательно перемешивают. Затем
добавляют 2 мл 0,75 %-ного раствора ТБК, перемешивают
и ставят на 15 мин в кипящую водяную баню. Пробы охлаждают и центрифугируют при
4000 об./мин в течение 10
мин. В надосадочной жидкости определяют оптическую
плотность при длине волны 532 нм в кювете с длиной
оптического пути 10 мм против слепой пробы, содержащей 4 мл 0,1 М трис-HCl буфера, 2 мл 30 %-ного
раствора ТХУ и 2 мл 0,75 %-ного раствора ТБК и
проведенной через вышеописанные процедуры.
Расчет содержания МДА (нмоль/г ткани) в мозге производят по
следующей формуле:
,
где Е – оптическая плотность; V – конечный объем пробы (8 мл);
1,56·105 – коэффициент молярной экстинкции; С – навеска ткани
(г).
О скорости неиндуцированных (спонтанных) и индуцированных прооксидантами (НАДФН- и аскорбат-зависимых) процессов пероксидации
липидов тканей мозга судят по разности количества МДА до и после 10 мин
инкубации.
Литература
Лемешко В.В., Никитченко Ю.В., Свич И.В., Овсянников С.Е. Перекисное окисление липидов биомембран и его ферментативная регуляция при старении крыс // Укр. биохим. журн. – 1987. – Т. 59, № 2. – С. 50–57.