4.5. Определение содержания ТБК-активных продуктов

перекисного окисления липидов в синаптосомах

Реактивы и их приготовление.

1. 0,67 % раствор ТБК.

2. 10 % раствор ТХУ.

3. 20 % раствор додецилсульфата натрия.

Ход определения. Синаптосомы суспендировали в среде, содержащей (в моль/л): NaCl – 132; KCl – 5; MgCl₂ – 1,3; NaH₂PO₄ – 1,2; CaCl₂ – 1,0; трис-малеат – 10; рН 7,4. Белок определяли по методу Лоури.

0,1 мл суспензии синаптосом с концентрацией белка 1–2 мг/мл вносят в 0,9 мл инкубационной среды. В контрольную пробу вместо суспензии синаптосом вносят 0,1 мл физ. раствора. После 40 мин инкубации в шейкере (37 °С) к суспензии добавляют 1 мл смеси, состоящей из 0,67 % ТБК, 10 % ТХУ, 20 % додецилсульфата натрия в соотношении 10:9:1. Смесь помещают в кипящую баню на 15 мин и затем охлаждают до 0 °С. Оптическую плотность определяют против контрольной пробы. Концентрацию ТБК-продуктов в пересчёте МДА определяют, исходя из коэффициента молярной экстинкции Е₅₃₂ = 1,5·10⁵ л/моль на спектрофотометре в двухлучевом режиме 532 нм против 560 нм и выражают в нмолях на 1 мг белка.

Литература

Лысакова Т.И., Аксенцев С.Л., Федорович С.В., и др. Влияние факторов ишемического повреждения на перекисное окисление липидов в синаптосомах мозга крыс // Биофизика. – 1997. – Т. 42, вып. 2. – С. 408–411.