3.2. Определение нитратов в плазме крови

 

Количественное определение концентрации NO в тканях затруднено из-за короткого времени жизни этого свободного радикала. Для оценки продукции NO наиболее часто применяется измерение концентрации стабильных метаболитов NO – нитритов и нитратов, в биологических жидкостях.

В плазме крови нитрит образуется при аутоокислении NO, который синтезируется эндотелиальной NO-синтазой:

2NO + О2 → 2NO2

NO + NO2 → N2O3 → NO2 + NO+

(NO+ может участвовать в формировании S-нитрозотиолов и N-нитрозоаминов).

Плазменный уровень нитритов коррелирует с активностью эндотелиальной NO-синтазы, и поэтому NO2 считают маркером активности этого фермента. При нормоксии нитриты окисляются в нитраты при участии оксигемоглобина.

Нитриты считают депо NO. Образовавшийся нитрит поступает в эритроцит и взаимодействует с дезоксигемоглобином:

NO2 + дезоксиHb (Fe2+) + Н+MetHb (Fe3+) + NO +ОН.

Образующийся в ходе нитритредуктазной реакции NO может оказать дистантные регуляторные эффекты и имеет важное значение в нитрит-зависимой вазодилятации при гипоксии.

Принцип метода. Определение основано на восстановлении нитратов металлическим кадмием до NO2:

NO3 + Cd + H2O = NO2 + 2OH + Cd2+

и последующим определением образующихся нитритов по цветной реакции с реактивом Грисса.

Реактивы и их приготовление.

1. 50 % раствор сульфата цинка.

2. 17 % раствор феррицианида калия.

3. Аммиачный буфер. 50 мл концентрированной соляной кислоты (плотность 1,19 г/см3) + 600 мл дистиллированной воды + 135 мл концентрированного водного аммиака (плотность 0,9 г/см3). После проверки pHH 9,6–9,7) объем раствора доводят дистиллированной водой до метки.

4. 0.1 н. соляная кислота.

5. Раствор сульфаниламида. В колбу емкостью на 250 мл помещают 0,1 г сульфаниламида + 200 мл дистиллированной воды + 10 мл концентрированной соляной кислоты. Выдерживают в кипящей водяной бане до полного растворения осадка (раствор хранят не более 2-х недель).

6. Раствор N-(1-нафтил)-этилендиаминдигидрохлорида (НЭДа). 0,1 г НЭДа растворяют в мерной колбе вместимостью 50 мл в дистиллированой воде и доводят объем раствора до метки (раствор хранят не более 2-х недель).

7. 5 М соляная кислота.

Приготовление губчатого кадмия. Цинковые гранулы средней величины (100–120 шт.) распределяют по дну кристаллизатора диаметром от 25 до 30 см и заливают раствором серно-кислого кадмия (37 г сернокислого кадмия растворяют в воде и разбавляют водой до 1000 мл). Через 3–4 ч осадок кадмия отделяют от цинка и помещают в стакан с водой, избегая соприкосновения с воздухом, и дважды промывают водой. Осадок кадмия и 400 мл раствора помещают в гомогенизатор и измельчают в течение 10 с. Измельченный кадмий переносят в стакан и отмывают водой от пылевидных частиц. После этого его оставляют на ночь в 0,1 н. растворе НСl, перемешивают несколько раз для удаления всех пузырьков газа из кадмия. Кадмий необходимо хранить под слоем воды.

Омеднение кадмия. 120 г кадмия помещают в стакан емкостью на 1 л, промывают 300 мл 0,1 н. соляной кислоты, затем дистиллированной водой и заливают 500 мл раствора сульфата меди (10 г сульфата меди растворяют в 500 мл дистиллированной воды). Перемешивают до почти полного обесцвечивания раствора сульфата меди (до появления черных мелкодисперсных частиц). После омеднения кадмий тщательно отмывают дистиллированной водой от мелких частиц, не осаждающихся в течение 2–3 с после интенсивного перемешивания кристаллов омеднённого кадмия в стакане с водой.

Рис. 4. Установка для восстановления нитратов: 1 – стеклянная кадмиевая колонка; 2 – соединение на шлифе или резиновая пробка; 3 – сборник; 4 – стеклянная трубка; 5 – резиновая соединительная трубка; 6 – кран; 7 – стеклянная вата

 

Подготовка кадмиевой колонки к работе. Собирают установку согласно рис. 4. На дно стеклянной колонки помещают тонкий слой стеклянной ваты, колонку заполняют водой и вносят суспензию кадмия фарфоровой ложкой на высоту 13–15 см. При заполнении колонки дают воде периодически стекать, следя, чтобы уровень воды не опускался ниже поверхности кадмия. Поверхность кадмия в колонке должна быть всегда покрыта жидкостью.

Регенерирование кадмиевой колонки. Перед началом работы и после каждого анализа кадмиевую колонку промывают последовательно 25 мл 0,1 н. соляной кислоты, 50 мл дистиллированной воды и 25 мл аммиачного буфера, разбавленного в 10 раз. Уровень жидкости всегда должен быть выше слоя кадмия.

 

Проверка восстановительной способности кадмиевой колонки

а) Восстановительную способность кадмиевой колонки проверяют каждый раз перед проведением серии анализов.

При закрытом кране в сборник колонки пипеткой вносят 20 мл рабочего раствора азотнокислого калия и 5 мл аммиачного буферного раствора. Устанавливают скорость элюции 3–5 мл/мин и собирают элюат в мерную колбу вместимостью 100 мл. Когда сборник опустеет, стенки его дважды смывают водой порциями по 15 мл, и воду также пропускают через  слой кадмия. Собирают около 100 мл элюата, доводят объем до метки водой и перемешивают.

б) Проводят контрольное определение, повторяя операцию, как указано выше, используя 20 мл воды вместо раствора азотнокислого калия.

в) В две мерные колбы вместимостью 50 мл вносят пипеткой в одну 10 мл испытуемого элюата, в другую 10 мл контрольного элюата и далее проводят определение с реактивом НЭДа, как описано ниже.

Если содержание нитрит-иона, найденного по градуировочному графику, менее 0,27 мкг в 1 мл измеряемого раствора (менее 90 % расчетного значения), колонку переподготавливают. Для этого из колонки пористый кадмий переносят в стакан, содержащий раствор 2 н. HCl, выдерживают 10 мин, промывают несколько раз водой, заполняют колонку и снова определяют восстановительную способность кадмиевой колонки.

 

Построение градуировочного графика для определения нитрат/нитрит ионов

 

Реактивы и их приготовление.

1. Основной стандартный раствор нитратов. 1,630 г калия азотнокислого (высушенного при t = 110–120C до постоянной массы) помещают в мерную колбу вместимостью 1 л, растворяют в дистиллированной воде и доводят водой до метки (хранят в темной посуде не более 6 месяцев).

2. Рабочий раствор нитратов. 10 мл основного стандартного раствора нитратов в колбе вместимостью 1 л доводят дистиллированной водой до метки. 1 мл этого раствора содержит 10 мкг NO3 (хранят 1 месяц).

Ход определения. Построение калибровочной кривой. В мерные колбы вместимостью 25 мл вносят 0 (контрольный раствор), 1, 2, 4, 8, 10 мл рабочего раствора нитратов, доводят до объема 20 мл дистиллированной водой, 5 мл аммиачного буфера и перемешивают.

Через предварительно промытую кадмиевую колонку пропускают со скоростью 3–5 мл/мин сначала один из полученных растворов нитратов, затем 25 мл дистиллированной воды, собирают элюат в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем до метки.

После того, как один из растворов нитратов пропущен через колонку, собран в колбу (50 мл) и доведен до метки дистиллированной водой, 25 мл полученного элюата помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и проводят цветную реакцию (т. е. последовательно добавляют 5 мл раствора сульфаниламида, 1 мл 5 М раствора соляной кислоты, перемешивают и оставляют на 5 мин, а затем добавляют 1 мл раствора НЭДа). Объем пробы доводят до метки дистиллированной водой и через 10 мин определяют оптическую плотность в кюветах толщиной 1 см при длине волны 538 нм по отношению к контрольному раствору.

По полученным данным строят градуировочный график, откладывая по оси ординат значение оптической плотности, а по оси абсцисс значения концентрации нитрат/нитрит-иона: 0,1; 0,2; 0,4; 0,8 и 1,0 мкг/мл.

Ход анализа. В центрифужные пробирки вместимостью 10 мл помещают 1 мл 50 % раствора сульфата цинка и 1 мл 17 % раствора феррицианида калия (K4Fe(CN)6), 1 мл плазмы крови. Затем прибавляют 2 мл аммиачного буфера и 5 мл дистиллированной воды. Полученную смесь перемешивают и центрифугируют в течение 20 мин при 2500 об./мин. Параллельно проводят холостой опыт.

При осаждении белков важно соблюдать необходимое значение pH во избежание получения мутного фильтрата, появляющегося при pH менее 8,5 при пропускании исследуемого раствора через колонку. Образующийся осадок затрудняет работу колонки. Поэтому при pH менее 8,5 необходимо добавлять 30 % раствор NaOH.

Отбирают аликвоту центрифугата объемом 5 мл в центрифужную пробирку на 10 мл, прибавляют 2,5 мл аммиачно-хлоридного буфера, 2,5 мл дистиллированной воды, перемешивают и пропускают через колонку с губчатым кадмием вначале холостую пробу, затем испытуемые.

После того как пройдет первая порция (10 мл испытуемого раствора) в те же пробирки заливают 10 мл дистиллированной воды, ополаскивают и вновь пропускают через колонку. И так 3 раза.

Весь элюат собирают в колбу на 50 мл, не доводя объём раствора в колбе до метки примерно на 10 мл. Затем проводят цветную реакцию.

Концентрацию нитрат/нитрит ионов определяют по градуировочному графику. Оптическую пробу определяют против нулевого (холостая проба) раствора.

Содержание нитрат/нитрит-ионов в анализируемых образцах рассчитывают по формуле:

,

где С1 – концентрация нитрат/нитрит-ионов в фотометрируемом растворе, найденная по градуировочному графику (в мкг/мл); V1 – общий объем безбелкового экстракта (мл); V2 – общий объем фотометрируемого раствора (мл); V3 – объем образца, взятый для анализа (мл); V4 – объем безбелкового экстракта, взятый для дальнейшего анализа (мл).

Для полного восстановления кадмия периодически (после шестикратного использования кадмиевой колонки) извлекают его из колонки и оставляют на ночь в 0,1 н. соляной кислоте. Перед тем как его внести обратно в колонку вновь проводят омеднение.

 

Литература

1. Бондаренко О.Н., Бондаренко Н.А., Малышев И.Ю., Манухина Е.Б. Антистрессорный эффект оксида азота // Изв. АН. Сер. биологическая. – 2001. – № 4. – С. 459–466.

2. Емченко Е.А., Цыганенко О.И., Ковалевская Т.В. Универсальный метод определения нитратов в биосредах организма // Клинич. лаб. диагностика. – 1994. – № 6. – С. 19–20.