2.7. Определение содержания гемоглобина в гемолизате

цианметгемоглобиновым методом

Принцип метода. Гемоглобин при взаимодействии с железосинеродистым калием (красная кровяная соль) окисляется в метгемоглобин (гемиглобин), образующий с ацетонциангидрином окрашенный гемиглобинцианид, интенсивность окраски которого пропорциональна количеству гемоглобина.

Оборудование: фотоэлектроколориметр.

Реактивы и их приготовление.

1. Ацетонциангидрин (2 ампулы по 0,5 мл – 0,47 г).

2. Калий железосинеродистый (2 флакона по 200 мг).

3. Натрий бикарбонат (2 флакона по 1 г).

4. Стандартный раствор гемиглобинцианида. Концентрация гемиглобинцианида в стандартном растворе производства фирмы «Реанал» (Венгрия) составляет 597,5 г/л (59,75 %), что соответствует 150 г/л гемоглобина при разведении крови 251 раз (15 г%). Стандартный раствор хранят в холодильнике при 4°С, в защищенном от света месте (предохранить от замораживания).

5. Трансформирующий раствор. Содержимое трех флаконов – 1, 2 и 3, количественно переносят в мерную колбу и доводят дистиллированной водой до 1 л. Раствор стабилен при хранении в склянке из темного стекла при комнатной температуре в течение нескольких месяцев. При появлении осадка или обесцвечивании раствор непригоден для употребления.

Ход определения. 0,02 мл гемолизата приливают к 5 мл трансформирующего раствора в пробирке (разведение в 251 раз) и хорошо перемешивают. Через 10 мин измеряют оптическую плотность на фотоколориметре при длине волны 500–600 нм в кювете с толщиной слоя жидкости 10 мм против холостой пробы (трансформирующий раствор). При тех же условиях измеряют и стандартный раствор.

Концентрацию гемоглобина рассчитывают по формуле:

,

где X – концентрация гемоглобина, г/л (г %); E_о и E_ст – экстинкция опытной пробы и стандартного раствора; С – концентрация гемиглобинцианида в стандартном растворе, г/л (г %); К – коэффициент разведения крови; 0,001 – коэффициент пересчета.