2.5. Методика выделения синаптосом

Принцип метода. Субклеточные частицы, нанесенные на градиент сахарозы, под действием центробежного ускорения двигаются до зоны, соответствующей их плавучей плотности.

Отбор проб и их хранение. Крыс забивают декапитацией. Вскрывают череп и быстро извлекают головной мозг. Мозг переносят в холодный физиологический раствор. Через несколько минут его обсушивают фильтровальной бумагой, очищают от сосудистых оболочек. На холоде отделяют кору больших полушарий головного мозга и сразу же используют в работе.

Оборудование: центрифуга с охлаждением, магнитная мешалка, стеклянный гомогенизатор с тефлоновым пестиком.

Реактивы и их приготовление.

1. 0,9 %-ный раствор хлорида натрия.

2. 0,32 М раствор сахарозы.

3. 0,32 М раствор сахарозы, приготовленный на 0,01 М трис-HCl буфере (рН 7,4), содержащий 1 мМ ЭДТА (среда гомогенизации).

4. 0,8 М раствор сахарозы.

5. 0,15 М раствор сахарозы.

Все растворы сахарозы готовят перед опытом.

Ход определения. 1 г коры больших полушарий мозга измельчают холодным скальпелем, а затем переносят в стеклянный гомогенизатор. Туда же добавляют 5 мл среды гомогенизации (0,32 М сахароза на 0,01 М трис-HCl-буфере, содержащем 1 мМ ЭДТА). С помощью тефлонового пестика мозг гомогенизируют вручную. Затем гомогенизацию продолжают с помощью электромотора (1000 об./мин), делая 10 проходов вверх и вниз и после минутного перерыва еще столько же раз. Во избежание образования пены при гомогенизации нельзя допустить выхода пестика из гомогената. После гомогенизации доливают необходимое количество среды гомогенизации для получения 10 %-ного (1 г ткани + 9 мл среды гомогенизации) гомогената.

Полученный гомогенат центрифугируют при 800 g в течение 10 мин для осаждения неразрушенных кусочков ткани, кровеносных сосудов, ядер клеток. Супернатант сливают в стоящую во льду пробирку. К осадку добавляют среду выделения до прежнего объема и после суспендирования с помощью пипетки с узким носиком вновь центрифугируют при тех же условиях. Объединенные супернатанты разливают в две пробирки (приблизительно по 7 мл) и центрифугируют при 10000 g в течение 20 мин. Супернатант сливают. Осадок представляет собой «грубую» митохондриальную фракцию, в которую входят митохондрии, синаптосомы, миелин. В каждой пробирке полученные осадки суспендируют в 1 мл 0,32 М сахарозы, а затем их объединяют. 2 мл суспензии «грубых» митохондрий наносят на 7 мл 0,8 М сахарозы и центрифугируют при 10000 g в течение 25 мин. После центрифугирования фракции распределяются следующим образом (рис. 2):

а) белый слой миелина на границе 0,3–0,8 М сахарозы;

б) легкие синаптосомы – частицы, взвешенные по всему объему 0,8 М сахарозы;

в) митохондрии и тяжелые синаптосомы.

Сначала отбирают фракцию миелина и тщательно вытирают фильтровальной бумагой стенки пробирки. Затем осторожно сливают в стоящий во льду бюкс фракцию синаптосом и разбавляют их до концентрации сахарозы 0,3–0,35 М. Для этого отобранную фракцию синаптосом на магнитной мешалке осторожно, во избежание шока, разводят холодной 0,15 М сахарозой. Синаптосомы осаждают при 14000 об./мин в течение 25 мин.

Литература

Hajos F. An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity // Brain Res. – 1975. – V. 93, № 3. – P. 485–489.