2.4. Выделение мембран эритроцитов

Принцип метода. Эритроциты после гипоосмотического гемолиза отмывают от гемоглобина многократным их промыванием буферным раствором с низкой ионной силой.

Отбор проб и их хранение. Смешанную артериальную и венозную кровь собирают в стеклянные пробирки с гепарином (200 ед./мл).

Оборудование. Скоростная центрифуга с охлаждением типа К-24.

Реактивы и их приготовление.

1. Гемолизирующий буфер. 0,01 М трис-HCl буфер (рН 7,8 при 20°С). В мерной колбе вместимостью 500 мл растворяют в дистиллированной воде 605,7 мг триса, рН доводят 1 н. HCl, объем раствора доводят дистиллированной водой до метки.

2. Отмывающий буфер. 0,01 М трис-HCl буфер (рН 7,8 при 20°С), содержащий 1,5 мМ ЭДТА. В мерной колбе на 500 мл растворяют в дистиллированной воде 605,7 мг триса и 279,2 мг ЭДТА, рН доводят до необходимого значения 1 н. HCl; объем раствора доводят до метки дистиллированной водой.

3. 0,145 М хлорид натрия, приготовленный на 0,01 М трис-HCl буфере.

Ход работы. Для осаждения эритроцитов собранную кровь центрифугируют при 1500 об./мин в течение 10 мин. Плазму удаляют, а верхний слой эритроцитов, содержащий лейкоциты, осторожно собирают на фильтровальную бумагу и отбрасывают. Затем эритроциты 3 раза промывают охлажденным физиологическим раствором, каждый раз осаждая клетки при 1500 об./мин в течение 10 мин, удаляя верхний слой эритроцитов фильтровальной бумагой. Один объем отмытых эритроцитов быстро и энергично смешивают с 20 объемами охлажденной до 4°С гемолизирующей среды и выдерживают при этой температуре в течение 5 мин.

Гемолизат фильтруют через нейлоновый фильтр, а затем центрифугируют при 14000 об./мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок теней промывают 5 раз 0,01 М трис-HCl буфером, каждый раз осаждая их при 14000 об./мин в течение 20 мин. Конечный осадок «белых» теней суспендируют в подходящей среде и используют в опыте, либо замораживают и хранят при –20°С.

Литература

Казенов А.М., Маслова М.Н., Шалабодов А.Д. Исследование активности АТФазы в эритроцитах млекопитающих // Биохимия. – 1984. – Т. 49, № 7. – С. 1089–1095.